Pupylierung in Corynebacterium glutamicum

Die Pupylierung beschreibt eine posttranslationale, kovalente Proteinmodifikation durch das
kleine (< 100 Aminosäuren) Protein Pup, welches bisher nur in Actinobakterien erforscht
wurde und Proteine für die Proteolyse über das Proteasom markiert (Pup-Proteasom-
System). Das zu den Actinobakterien gehörende Corynebacterium glutamicum besitzt die
Gene, welche für die bekannten Teile der Pupylierungsmaschinerie kodieren (pup, pafA, arc
und dop), aber keines für ein Proteasom. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb untersucht,
ob die Pupylierung in C. glutamicum aktiv ist, welche Proteine pupyliert werden und
welche Funktionen die Pupylierung in Abwesenheit eines Proteasoms ausübt.
In dieser Arbeit konnte über Anreicherung von Polyhistidin-getaggtem Pup und MS/MSAnalysen
gezeigt werden, dass in C. glutamicum mindestens 55 Proteine pupyliert sind, welche
zu 60% Proteine des Metabolismus als auch der Translation sind. Damit konnte das erste
Mal gezeigt werden, dass C. glutamicum in vivo eine aktive Pupylierungsmaschinerie besitzt.
Zusätzlich wurde ein System zur in-vitro-Pupylierung von Proteinen mit Pup und Pup-
Ligase PafA aus C. glutamicum etabliert, die es in Zukunft erlaubt, einzelne Proteine auf eine
Pupylierung zu untersuchen sowie weitere in vitro-Studien mit pupylierten Proteinen durchzuführen.
Um die physiologische Rolle der Pupylierung zu untersuchen, wurden Mutanten der Pupylierungsmaschinerie,
die kein Pup (? pup), keine Depupylase Dop (? dop) oder AAA+-ATPase
ARC zur Erkennung pupylierter Proteine (? arc) aufwiesen, sowohl unter Standard-
Kultivierungsbedingungen als auch unter Eisenmangel charakterisiert. Unter Eisenmangel
zeigten alle Mutanten im Vergleich zum Wildtyp ein reduziertes Wachstum. Für die ? pup-
Mutante konnten außerdem Unterschiede im Transkriptom sowie im zytosolischen Proteom
unter Eisenmangel im Vergleich zum Wildtyp gezeigt werden, welche hauptsächlich auf die
Eisen-abhängigen Effekte der Transkriptionsregulatoren DtxR und RipA zurückgeführt werden
kann.
Untersuchungen von Deletionsmutanten der Eisenspeicherproteine Ferritin (? ftn) und Dps
(? dps) in Kombination mit Deletionen in Genen der Pupylierungsmaschinerie zeigten, dass
der Wachstumsdefekt der ? pup- und ? arc-Mutanten unter Eisenmangel durch Deletion der
Eisenspeicherproteine aufgehoben werden kann. Außerdem löste der Austausch des pupylierten
Lysin-Rests in Ferritin einen zur pup-Deletion vergleichbaren Wachstumsdefekt aus.
Die Defekte der Mutanten können damit auf die defekte Pupylierung der Eisenspeicherproteine
Ferritin und Dps zurückgeführt werden. Die Pupylierung könnte folglich einen völlig neuartigen
Mechanismus zur Eisenfreisetzung in Actinobakterien darstellen.